研究背景：

結(jié)直腸癌是全球五大致命癌癥之一，在中國(guó)是第二大常見(jiàn)惡性腫瘤。肝轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的主要原因，25%的患者初診時(shí)已有肝轉(zhuǎn)移，術(shù)后15%-25%因肝轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，90%的肝轉(zhuǎn)移患者無(wú)法獲得有效治療，IV期患者5年生存率僅24%。N-糖基化修飾在蛋白質(zhì)的多種功能中起關(guān)鍵作用，且與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，但目前關(guān)于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的N-糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少。

研究方法：

收集14例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)性病灶和配對(duì)肝轉(zhuǎn)移病灶樣本，經(jīng)處理后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析。對(duì)多種細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建CTSD突變體，通過(guò)轉(zhuǎn)染、感染等操作，進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建裸鼠皮下腫瘤和肝轉(zhuǎn)移模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況。

主要研究結(jié)果：

1.CRC患者肝轉(zhuǎn)移性病變表現(xiàn)出比原發(fā)性病變更高的CTSD N-糖基化水平

通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)，研究人員對(duì)比了14例原發(fā)性病灶和14例配對(duì)肝轉(zhuǎn)移病灶的N-糖基化修飾差異，共檢測(cè)到139種N-糖基化蛋白、185個(gè)N -糖基化修飾位點(diǎn)、490個(gè)完整結(jié)構(gòu)的N-糖肽以及71種糖基。其中46個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)此前未被Uniprot平臺(tái)報(bào)道。在肝轉(zhuǎn)移病灶中，有13個(gè)位點(diǎn)的N-糖基化修飾水平變化超過(guò)1.5倍。N-糖基化位點(diǎn)周?chē)陌被嵝蛄芯哂幸欢ūＪ匦浴?/span>44.94%的N-糖基化位點(diǎn)被單一、固定的糖基修飾，20.86%的N-糖蛋白含有多個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)。借助GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些N-糖基化蛋白可能屬于分泌蛋白和膜蛋白。在生物學(xué)過(guò)程方面，主要參與細(xì)胞間粘附、蛋白水解和免疫反應(yīng)等；分子功能則主要與結(jié)合活性相關(guān)。KEGG通路富集分析表明，它們可能涉及溶酶體、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用以及藥物-受體等相關(guān)途徑。此外，在 Cathepsin D（CTSD）的第263位殘基處，發(fā)現(xiàn) 2488.06545（PrecursorMH）作為H (6) N (2) 糖基的結(jié)構(gòu)修飾，在肝轉(zhuǎn)移病灶相對(duì)于原發(fā)性病灶的修飾變化倍數(shù)絕對(duì)值最高。同時(shí)，H (5) N (2)和H (7) N (2)的 N-糖基化修飾水平在肝轉(zhuǎn)移病灶中也顯著增加，這表明肝轉(zhuǎn)移病灶中CTSD第263位殘基的N-糖基化修飾水平整體高于原發(fā)性病灶。

圖1結(jié)直腸癌原發(fā)性病灶和配對(duì)肝轉(zhuǎn)移病灶中N - 糖基化蛋白的相關(guān)分析

2. CTSD糖基化修飾特征及相關(guān)位點(diǎn)突變對(duì)蛋白的影響

對(duì)5例CRC患者的原發(fā)性病灶和配對(duì)肝轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移病灶中CTSD的N -糖基化水平高于原發(fā)性病灶。同時(shí)，在多種CRC細(xì)胞系中評(píng)估CTSD的糖基化水平，CTSD在不同CRC細(xì)胞系中的糖基化水平存在差異。使用PNGase F和衣霉素處理細(xì)胞系后，CTSD 的分子量下降，表明CTSD存在N-糖基化修飾，且經(jīng)處理后從糖基化形式轉(zhuǎn)變?yōu)榉翘腔问健７治霭l(fā)現(xiàn)CTSD在天冬酰胺殘基 263（N263）處具有進(jìn)化保守性。UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CTSD有2個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)（天冬氨酸殘基134和263）。隨后在SW480和 SW620 細(xì)胞系中沉默內(nèi)源性CTSD 表達(dá)，再分別轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼野生型 CTSD（CTSD WT）或突變型CTSD（CTSD N263Q、CTSD N134Q/N263Q）的外源質(zhì)粒，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞模型。通過(guò)對(duì)比突變前后及經(jīng) PNGase F 處理的CTSD分子量變化，確定CTSD僅在殘基 134和263處存在N-糖基化修飾位點(diǎn)。

  圖2 CTSD N-糖基化修飾位點(diǎn)驗(yàn)證

3.CTSD N263位點(diǎn)糖基化修飾促進(jìn)CRC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

將CTSD野生型（WT）和N263Q突變型（非糖基化）的SW480細(xì)胞分別皮下注射至裸鼠，成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明CTSD WT組腫瘤體積顯著大于N263Q組，且腫瘤外觀更明顯、重量更重。在肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型中，WT組裸鼠肝臟表面可見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而N263Q組肝臟無(wú)肉眼可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶；HE染色顯示WT組肝臟存在典型轉(zhuǎn)移灶，N263Q組肝臟組織正常，無(wú)轉(zhuǎn)移跡象，表明CTSD在N263位點(diǎn)的N -糖基化修飾是其促進(jìn)CRC生長(zhǎng)和肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，缺失該修飾（N263Q突變）會(huì)導(dǎo)致腫瘤增殖能力下降、皮下腫瘤生長(zhǎng)速度顯著減慢、轉(zhuǎn)移潛能喪失。

圖3 CTSD N263位點(diǎn)糖基化修飾位點(diǎn)驗(yàn)證對(duì)CRC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響

4.CTSD N-糖基化修飾對(duì)其細(xì)胞定位、穩(wěn)定性及功能活性的影響

GeneCards顯示CTSD主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)、溶酶體和內(nèi)體。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型（WT）CTSD與溶酶體標(biāo)記物LAMP1、早期內(nèi)體標(biāo)記物EEA1、晚期內(nèi)體標(biāo)記物Rab7共定位，表明其正常運(yùn)輸至溶酶體和內(nèi)體；而突變體（N263Q、N134Q/N263Q）CTSD喪失與上述標(biāo)記物的共定位能力，滯留于細(xì)胞質(zhì)或錯(cuò)誤定位。單突變體（N263Q）CTSD分泌量顯著低于WT細(xì)胞，提示N263糖基化缺失抑制其分泌；而雙突變體（N134Q/N263Q）CTSD 分泌量反而高于WT細(xì)胞，表明雙位點(diǎn)糖基化缺失可能解除某種分泌抑制機(jī)制。環(huán)己酰亞an（CHX）追蹤顯示WT CTSD在處理5小時(shí)后仍保持較高水平，半衰期較長(zhǎng)，N263Q 突變體CTSD在處理3小時(shí)后顯著降解，半衰期縮短。使用CTSD特異性底物（GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2）和熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WT CTSD的酶活性顯著高于N263Q和N134Q/N263Q 突變體，雙突變體酶活性低，單突變體次之，表明糖基化位點(diǎn)數(shù)量與酶活性呈正相關(guān)。這表明N263糖基化是CTSD進(jìn)入溶酶體/內(nèi)體的必要條件，確保其在酸性環(huán)境中發(fā)揮功能，糖基化抑制蛋白降解，延長(zhǎng)CTSD的半衰期，并直接影響CTSD的催化效率，促進(jìn)其蛋白酶功能。此外，N263位點(diǎn)在定位和穩(wěn)定性調(diào)控中起主導(dǎo)作用，而N134可能通過(guò)協(xié)同作用影響分泌和酶活。

圖4 CTSD第134和263位的N-糖基化調(diào)節(jié)其折疊位置、穩(wěn)定性和功能活性

5. CTSD N-糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制研究

隨后探究了 CTSD的N-糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)鑒定了參與其糖基化的轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體及關(guān)鍵亞基。利用FLAG標(biāo)簽富集CTSD野生型（WT）和N263Q突變體的互作蛋白，通過(guò)質(zhì)譜分析差異結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)CTSD WT特異性結(jié)合235種蛋白，N263Q結(jié)合191種蛋白，其中45種蛋白僅與WT互作，其中DDOST是N -糖基轉(zhuǎn)移酶。N -糖基化起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）復(fù)合體，分為OST-A（催化亞基 STT3A）和OST-B（催化亞基STT3B），非催化亞基如DDOST可穩(wěn)定復(fù)合體與底物的結(jié)合。隨后，通過(guò)CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，STT3A、STT3B和DDOST在結(jié)腸癌組織中均顯著高表達(dá)，提示其與CRC進(jìn)展相關(guān)。在SW480 細(xì)胞中敲除STT3B或DDOST后，CTSD分子量顯著降低，表明N- 糖基化修飾缺失；而敲除STT3A無(wú)明顯變化。免疫共沉淀驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，CTSD WT與STT3B、DDOST顯著互作，而N263Q突變體與兩者的結(jié)合能力明顯減弱，CTSD與STT3A無(wú)明顯結(jié)合，表明STT3B是主要催化亞基。此外，免疫熒光共定位的結(jié)果表明CTSD與STT3B、DDOST在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域顯著共定位，而與STT3A無(wú)共定位。

圖5 CTSD N-糖基轉(zhuǎn)移酶鑒定

6. CTSD的N-糖基化修飾通過(guò)降解ACADM、調(diào)控鐵死亡促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制

通過(guò)比較CTSD野生型（WT）和N263Q突變型SW480 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，篩選鑒定出391個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs），其中WT中高表達(dá)的蛋白主要富集于蛋白酶活性、細(xì)胞遷移等通路，N263Q中高表達(dá)的蛋白涉及脂肪酸代謝、抗氧化反應(yīng)等，通過(guò)CTSD WT特異性互作蛋白與DEPs的交集分析，初步篩選出8個(gè)候選分子：ACADM、PRDX3、ALDH2、EHHADH、DHCR7、TGFB1I1、IDH2、ALDH1A1。臨床相關(guān)性分析顯示，ACADM和PRDX3高表達(dá)患者的預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)者，提示兩者可能為抑癌因子；TNM 分期分析發(fā)現(xiàn)ACADM表達(dá)隨CRC惡性程度（TNM分期）進(jìn)展而降低，在肝轉(zhuǎn)移（IV 期）患者中表達(dá)低，表明 ACADM與轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)，因此選為后續(xù)研究靶點(diǎn)。在CTSD WT和N263Q細(xì)胞中，CTSD表達(dá)水平相當(dāng)，但N263Q細(xì)胞的ACADM蛋白水平顯著升高，提示CTSD糖基化促進(jìn) ACADM 降解。此外，Co-IP的結(jié)果表明CTSD WT與ACADM顯著結(jié)合，而N263Q突變體無(wú)法與 ACADM互作，表明CTSD的N263糖基化是其結(jié)合并降解ACADM的前提。最后，在90 例CRC組織中，CTSD 表達(dá)與ACADM 呈顯著負(fù)相關(guān)，且兩者在細(xì)胞質(zhì)中共定位，進(jìn)一步驗(yàn)證 CTSD 對(duì) ACADM 的降解作用在臨床樣本中普遍存在。

圖6 CTSD N263-糖基化修飾影響CTSD蛋白酶對(duì)ACADM的蛋白水解作用

研究結(jié)論：

本研究聚焦結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中N-糖基化修飾機(jī)制，CTSD的N263位點(diǎn)糖基化在肝轉(zhuǎn)移灶中顯著上調(diào)，該修飾由STT3B和DDOST糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體調(diào)控。CTSD糖基化通過(guò)維持其溶酶體定位、穩(wěn)定性及蛋白酶活性，促進(jìn)降解ACADM蛋白，進(jìn)而調(diào)控鐵死亡相關(guān)蛋白（ACSL4、SLC7A11、GPX4），增強(qiáng)CRC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，敲除N263 糖基化可抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及肝轉(zhuǎn)移。該研究揭示CTSD-N263 糖基化通過(guò)“STT3B/DDOST-ACADM-鐵死亡軸" 驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移，為CRC治療提供了新靶點(diǎn)與理論依據(jù)。

研究思維導(dǎo)圖：

參考文獻(xiàn)：

Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39716927; PMCID: PMC11831497.